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蛋白质测定法
发布时间:2016-03-28   点击次数:2039次

 

*法凯氏定氮法
1 钨酸沉淀法
    本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液中的非蛋白氮含量,计算出蛋白质的含量。
供试品溶液的制备 1)总氮测定溶液的制备精密量取供试品1ml,用生理氯化钠溶液准确稀释至每1ml含氮量约1mg
2)非蛋白氮测定溶液的制备精密量取供试品2ml,加水14ml10%钨酸钠溶液2ml、硫酸溶液(1.861002ml,摇匀,静置30分钟过滤,取滤液测定。
测定法 精密量取总氮测定溶液1ml,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(附录Ⅵ A)测定供试品中总氮含量。同时做空白对照。
精密量取非蛋白氮测定溶液5ml,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(附录Ⅵ A)测定供试品中非蛋白氮含量。
按下式计算
CTNmg/ml=VX1-V0)×c×14.01×n×2
               _________________________
V1
CNPNmg/ml=VX2-V0)×c×14.01×n×2
               _________________________
V2
CPNmg/ml=CTN-CNPN
供试品蛋白质含量(%,g/ml=CPN×6.25×100
                           _______________
1000
式中CTN为供试品溶液总氮含量,mg/ml;
CNPN为供试品溶液非蛋白氮含量,mg/ml;
VX1为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积,ml;
VX2为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积,ml;
V0为空白试验消耗酸滴定液的体积,ml;
c为硫酸滴定液的浓度,mol/L
CPN为供试品蛋白氮含量,mg/ml;
n为供试品的稀释倍数;
V1为供试品总氮测定溶液的体积,ml
V2为供试品非氮测定溶液的体积,ml
14.01为氮的相对原子质量;
6.25 为常数(1g氮相当于6.25g蛋白质)。
【附注】(1)供试品蛋白质含量如超过10%g/ml),除蛋白质时应适当加大供试品稀释倍数,10%钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例增加,使溶液中的钨酸浓度仍保持1%
2)总氮测定和非蛋白氮测定可用同一空白对照。
2 三氯醋酸沉淀法(新增)
本法系将供试品经三氯醋酸沉淀,通过测定该沉淀中的蛋白氮含量,计算出蛋白质的含量。
测定法   量取适宜体积的供试品(每1ml含蛋白质为4-10mg)于适宜的尖底离心管中,加等体积的12%三氯醋酸(12100)混匀,静置30分钟后,离心(4000/分钟),弃上清,用约3ml水分数次将沉淀洗入凯氏定氮瓶中,照氮测定法(附录VI A)测定供试品中总氮含量,同时做空白对照。
按下式计算:
 
                           VX-V0×C×14.01×2
供试品蛋白质含量(mg/ml= —————————————×6.25
                                       V
 
式中VX 为供试品消耗酸滴定液的体积,ml;
     V0为空白试验消耗酸滴定液的体积,ml;
     C为硫酸滴定液的浓度,mol/L;
     V 为供试品的体积,ml
 
第二法Lowry
本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物, 此复合物加入酚试剂后, 产生蓝色化合物, 该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,根据供试品的吸光度,计算供试品的蛋白质含量。
试剂1)酚试剂    取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,置1500ml蒸馏瓶中,加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml,上连回流管使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞微沸回流10小时。取下回流管,加入硫酸锂150g、水50ml、溴液几滴,煮沸约15分钟,驱除过量的溴。冷却,加水至1000ml,过滤,为酚试剂贮备液。
酚试剂贮备液   用氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)测定酸浓度,然后加水稀释至相当于1mol/L盐酸浓度。
2)碱性铜溶液   0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5 ml4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25 ml,摇匀,即得。本液应临用配制。
3)氢氧化钠滴定液(0.5mol/L)的配制及标定   取氢氧化钠适量,加水搅拌使溶解成饱和溶液,冷却后,置聚乙烯塑料瓶中,静止数日,澄清后,取澄清的氢氧化钠饱和溶液28ml,加新煮沸后冷却的水,使成1000ml,摇匀。
取在105干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g,精密称定,加新沸过的冷水50ml,振摇,使其尽量溶解;加酚酞指示剂2滴,用本液滴定;在接近终点时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解,滴定至溶液显粉红色。每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量,算出本液的浓度。
标准蛋白质溶液的制备    取人血白蛋白标准品一支,用水定量稀释至每1ml1mg,作为贮备液。精密量取贮备液2.5ml25ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即为每1ml100μg的标准蛋白质溶液。
测定法    精密量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置试管内,加水至1ml,加碱性铜溶液5ml,摇匀,室温放置10分钟, 快速加入酚试剂0.5 ml,摇匀,室温放置30分钟,显色后,照紫外-见分光光度法(附录Ⅱ A),在波长650nm处测定吸光度(呈色后,如发现浑浊,经每分钟3000转离心15分钟后,取上清液测定)。精密量取标准蛋白质溶液0.2ml0.4ml0.6ml0.8ml1.0ml分别置于试管中,自“加水至1ml”起,同法操作。准确量取水1ml,自“加碱性铜溶液5ml”起,同法操作,作空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度,求直线回归方程;将测得供试品的吸光度代入直线回归方程,即得供试品的蛋白质含量。
第三法 双缩脲法
本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色深浅与蛋白质含量成正比,利用标准蛋白质溶液作对照,采用紫外-可见分光光度法测定供试品蛋白质含量。
试剂   双缩脲试剂。取硫酸铜(CuSO4·5H2O3.0g、酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O9.0g、碘化钾5.0g、氢氧化钠24g,加水溶解并稀释至1000ml,摇匀,即得。
标准蛋白质溶液的制备   精密量取人血白蛋白标准品适量,用水定量稀释成每1ml 50mg的溶液。
供试品溶液的制备   精密量取适量的供试品,加水制成每1ml约含50mg的溶液。
测定法 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0.05ml置玻璃试管中,分别加双缩脲试剂4.0ml,混匀,置37水浴中30分钟,照紫外-可见分光光度法(附录Ⅱ A),在波长540nm处测定吸光度。另精密量取水0.05ml,自“加双缩脲试剂4.0ml”起,同法操作,作为空白对照。
按下式计算
蛋白质含量(mg/ml= A1×c×n
                    ——————
A2
式中A1为供试品溶液的吸光度;
A2为标准蛋白质溶液的吸光度;
c为标准蛋白质溶液的浓度,mg/ml
n为供试品稀释倍数。
【附注】本法的测定范围为1~10mg。
 

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